本发明公开青蒿素B的制备方法及其在免疫领域的应用。青蒿素B的提取分离方法为:青蒿叶干燥,粉碎,用有机溶剂渗漉/浸泡提取,60°C以下减压回收溶剂后,与柱层析硅胶混合,晾干,进行硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经有机溶剂如丙酮、乙醇等反复重结晶纯化,即得到青蒿素B。本发明青蒿素B(artemisinin B)用于制备免疫抑制的药物,具有显著的免疫抑制活性,可在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物和临床上应用。
1.一种化合物的制备方法,其特征在于该方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用4~8体积份有机溶剂浸泡24~76小时,用40~80体积份的有机溶剂渗漉,收集渗漉液,50~60°C以下减压回收溶剂得浸膏,用有机溶剂溶解后,与2~4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25~50倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯=1:0至5:5或石油醚-丙酮=1:0至6:4混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含目标化合物的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经有机溶剂反复重结晶纯化,即得;所述有机溶剂是指乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚或石油醚中的一种或几种;该方法所得化合物的结构式如下:ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="306"/>。
2.如权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于该方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用5体积份95%乙醇浸泡24小时,用50体积份95%乙醇渗漉,收集渗漉液,50°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:乙酸乙酯=1:0至5:5混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含目标化合物的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经丙酮反复重结晶纯化,即得。
3.如权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于该方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用4体积份乙酸乙酯浸泡50小时,用45体积份的乙酸乙酯渗漉,收集渗漉液,55°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:乙酸乙酯=1:0至5:5混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含目标化合物的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙酸乙酯反复重结晶纯化,即得。
4.如权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于该方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用7体积份石油醚浸泡70小时,用75体积份的石油醚渗漉,收集渗漉液,60°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有45倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:乙酸乙酯=1:0至5:5混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含目标化合物的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙醇反复重结晶纯化,即得。
5.如权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于该方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用8体积份丙酮浸泡48小时,用60体积份丙酮渗漉,收集渗漉液,50°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:丙酮=1:0至6:4混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含目标化合物的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙醇反复重结晶纯化,即得。
6.如权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于该方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用5体积份乙醚浸泡50小时,用40体积份的乙醚渗漉,收集渗漉液,55°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:丙酮=1:0至6:4混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含目标化合物的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经丙酮反复重结晶纯化,即得。
7.一种如权利要求1-6任一方法制备得到的所述化合物在制备免疫抑制的药物中的应用。
8.一种如权利要求1-6任一方法制备得到的所述的化合物在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。技术领域
本发明涉及一种青蒿素B(artemisininxa0B)的制备方法及其新用途,特别涉及一种青蒿素B(artemisininxa0B)在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物中的应用。
背景技术
近年来,随着社会工业化程度的逐步提高,自身免疫性疾病、超敏反应性疾病等由免疫反应过度而引起的疾病也在不断增加,寻找高效低毒的免疫抑制剂已成为当前一个世界性的研究热点。有证据表明,中药免疫抑制剂具有高效低毒的特殊疗效,但由于制剂质量难以控制、作用机制难以明确,限制了其在临床中的广泛应用。采用现代提取分离技术,从中药中获得具有免疫抑制活性的单体化合物,将克服这些不足,并有望创制免疫抑制新药。青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisiaxa0annuaxa0L的干燥地上部分,主要含有青蒿素、青蒿甲素、青蒿乙素、青蒿丙素、青蒿酸、青蒿内酯、黄酮、香豆素和挥发油等成分,具有清热解暑、除蒸、截疟等功效。其中,化学单体青蒿素(artemisinin,Art)由我国药学家首先于20世纪70年代提取分离得到,分子式C₁₅H₂₂O₅,是我国第一个被WHO认可按化药研究标准开发的高效抗疟药。通过近十年的实验及临床研究证实,青蒿中多种有效成分具有免疫抑制活性,对类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病都显示出不同程度的治疗或保护作用,具有抗炎和较为复杂的免疫抑制作用,但青蒿素B未见相关报道。青蒿乙素(Arteannuinxa0B;CASxa0No50906-56-4)为从中药青蒿(Artemisiaxa0annuaxa0L.)中提取分离得到的倍半萜内酯类化合物,被认为是抗疟活性成分青蒿素的生物合成前体,其化学结构和绝对构型经光谱[D.JeremiC,A.JokiC,A.Behbud,andxa0M.Stefanovic.Tetrahedronxa0lett.,3039(1973).]和X光衍射[D.G.Leppard,M.Rey,andxa0A.S.Dreiding,Helw.Chim.Acta.,57,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="492"/>602(1974)]方法确定。近代药理学研究表明,其不具有抗疟活性,但具有一定程度的抗细菌、抗真菌、解热活性。
发明内容
本发明目的在于提供一种青蒿素B的制备方法,本发明另一目的在于提供在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物中的应用。本发明目的是通过如下技术方案实现本发明青蒿素B的制备方法为:青蒿叶干燥后,粉碎,用有机溶剂渗漉/浸泡提取,60°C以下减压回收溶剂后,与柱层析硅胶混合,晾干,进行硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮混合溶剂,梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经有机溶剂反复重结晶纯化,即得。本发明青蒿素B的优选制备方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用4~8体积份有机溶剂浸泡24~76小时,用40~80体积份的有机溶剂渗漉,收集渗漉液,50~60°C以下减压回收溶剂得浸膏,用有机溶剂溶解后,与2~4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25~50倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯=1:0至5:5或石油醚-丙酮=1:0至6:4混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经有机溶剂反复重结晶纯化,即得。本发明青蒿素B的优选制备方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用5体积份量95%乙醇浸泡24小时,用50体积份95%乙醇渗漉,收集渗漉液,50°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:乙酸乙酯=1:0至5:5混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经丙酮反复重结晶纯化,即得。本发明青蒿素B的优选制备方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用4体积份乙酸乙酯浸泡50小时,用45体积份的乙酸乙酯渗漉,收集渗漉液,55°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:乙酸乙酯=1:0至5:5混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙酸乙酯反复重结晶纯化,即得。本发明青蒿素B的优选制备方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用7体积份石油醚浸泡70小时,用75体积份的石油醚渗漉,收集渗漉液,60°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有45倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:乙酸乙酯=1:0至5:5混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙醇反复重结晶纯化,即得。本发明青蒿素B的优选制备方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用8体积份丙酮浸泡48小时,用60体积份丙酮渗漉,收集渗漉液,50°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:丙酮=1:0至6:4混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙醇反复重结晶纯化,即得。本发明青蒿素B的优选制备方法为:青蒿叶1重量份干燥后,粉碎,用5体积份乙醚浸泡50小时,用45体积份的乙醚渗漉,收集渗漉液,55°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚:丙酮=1:0至6:4混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经丙酮反复重结晶纯化,即得。本发明所述的青蒿素B的制备方法中有机溶剂可以是乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或汽油中的一种或几种。所述重量份和体积份的关系为千克和升的关系。本发明所述的青蒿素B的制备方法中,所得青蒿素B的理化性质和波谱数据为:无色方形结晶,熔点151-153°C,[α]-73.5°C(C=1.01,MeOH),EI-MSm/e248(M⁺),分子式为C₁₅H₂₀O₃(元素分析:计算值%C72.6,H8.06;实测值%C72.09,H8.14);¹H-NMR(CDCl₃300Hz)614(1H,d,J=3Hz,13-CH=),5.42(1H,dJ=3Hz,13-CH=),2.70(lH,s,5-CH),1.34(3H,,15-CH₃),0.99(3H,d,J=6Hz,14-CH₃);¹³C-NMR(CDCl₃75Hz):43.9(C-1),16.4(C-2),24.5(C-3),58.2(C-4),58.7(C-5),8l.0(C-6),52.8(C-7),21.8(C-8),34.0(C-9),30.7(C-10),138.7(C-11),169.5(C-12),117.2(C-13),18.6(C-14),22.7(C-15)。本发明青蒿素B的一种新用途,用于制备免疫抑制的药物,具有显著的免疫抑制活性,可在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物和临床上应用。通过实验首次发现,青蒿素B可剂量依赖性地抑制LPS诱导大鼠腹腔细胞NO、PGE2生成,抑制LPS/IFN诱导细胞因子的产生释放。对人外周血单个核细胞也体现出同样的作用。附图说明:图1:本发明青蒿素B对大鼠腹腔细胞NO生成的影响图2:本发明青蒿素B对大鼠腹腔细胞PGE2生成的影响图3:本发明青蒿素B对大鼠腹腔细胞细胞因子分泌的影响图4:本发明青蒿素B对人外周血单个核细胞(PBMC)PGE2和细胞因子分泌的影响下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例11.实验材料1.1动物:8-10周龄雌性Wistar大鼠。1.2主要试剂:Ficoll-Paque(Amershamxa0Biosciences),LPS(E.coli0111:B4;Sigma;1ng/mL),ELISA试剂盒(R&Dxa0Systems,Minneapolis,MN)。培养基:RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich),含10%小牛血清,2mxa0ML-谷氨酰胺,50μg/ml庆大霉素和5大霉素^-5M2-巯基乙醇(购自Sigma),培养基在细胞培养前新鲜配制,细胞37培,5%CO₂培养。1.3受试药为从Artemisiaxa0annuaxa0L.中提取的系列化合物AA1-AA7,其中AA2为青蒿素B(artemisininxa0B)。2.实验方法2.1大鼠腹腔细胞获取:大鼠5-10只一笼(透明塑料鼠笼),在标准动物房喂养。灯光:6点-18点;温度:22-24°C。断椎处死后向腹腔中注射16ml生理盐水洗腹腔细胞,以2×10⁶cells/mL每孔100μl接种于Costar96孔板,37°C,5%CO₂孵育。培养基为含10%胎牛血清的RPMI-1640(Sigma-Aldrich,含2mMxa0L-glutamine,50μg/mlxa0gentamicin,5×10^-5M2-mercaptoethanol,allxa0Sigma)。2.2正常人外周血单个核细胞(peripheralxa0bloodxa0mononuclearxa0cells,PBMC)获取:从患者前臂静脉抽取血液,Ficoll-Paque(Amershamxa0Biosciences)分离上层淡黄色上层细胞,用10%胎牛血清的RPMI-1640重悬,终浓度为1.5x10⁶cells/ml,每孔100μl。与受试样品孵育24h后检测。2.3检测指标:大鼠腹腔细胞用LPS(1ng/mL)刺激后取细胞上清,比色法检测NO含量,ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α,LPS(10ng/mL)与IFN-γ(5ng/mL)共同刺激后检测VEGF。人PBMC用1μg/mLxa0LPS刺激18h后检测PGE2及IL-1β,IL-6和TNF-α。3.实验结果3.1对大鼠腹腔细胞NO生成的影响以大鼠腹腔细胞NO的基础表达为0,LPS1ng/mL诱导24h后,细胞上清中NO含量明显增高,达70μM。AA2,AA5和AA6可剂量依赖性地抑制NO浓度。其中AA2作用最强,IC50约为7.04μM(95%可信限区间为4.18-11.87μM)(见图1)。(n=4,数据均以mean±SEM表示,实验重复2次。下同)3.2对大鼠腹腔细胞PGE2生成的影响对照组大鼠腹腔细胞仅分泌微量的PGE2,LPS5μg/mL刺激24h后PGE₂含量明显增高。各受试样品均可剂量依赖性地抑制PGE2高表达,其中AA2的作用最强,IC₅₀约为2.70μM(95%可信限区间为1.12-6.48μM)(见图2)。3.3对大鼠腹腔细胞细胞因子分泌的影响LPS1ng/mL诱导24h可诱导细胞上清中IL-1β,IL-6,TNF-α高表达,达70μM。AA2,AA5和AA6可剂量依赖性地抑制细胞因子的浓度。其中AA2作用最为明显,IL-1□的IC₅₀约为1.06μM(95%可信限区间为0.61-1.85μM),IL-6的IC₅₀约为1.53μM(95%可信限区间为0.77-3.04μM),TNF-□的IC₅₀约为4.41μM(95%可信限区间为2.89-6.73μM),VEGF的IC₅₀约为1.21μM(95%可信限区间为0.69-2.12μM)(见图3)。3.4对人外周血单个核细胞(PBMC)PGE2和细胞因子分泌的影响取志愿者血液密度梯度离心法获取PBMC,以LPS1ng/mL诱导18h后PGE2的生成量作为100%,受试样品的抑制作用以如下公式计算:抑制率=[(X-control)-(LPS-control)]/(LPS-control)×100结果见图4、表1。表1对人外周血单个核细胞(PBMC)PGE2和细胞因子分泌的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>4.实验结论受试样品AA2可抑制大鼠腹腔细胞NO、PGE2的表达及细胞因子表达,具有显著的免疫抑制活性。可开发为治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的新型药物。下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。实施例1青蒿叶1kg干燥后,粉碎,加5L95%乙醇浸泡24小时,用50L95%乙醇渗漉,收集渗漉液,50°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干后,将其加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部,用石油醚-乙酸乙酯(1:0→5:5)梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经丙酮重结晶纯化,即得到青蒿素B。实施例2青蒿叶1kg干燥后,粉碎,用4L乙酸乙酯浸泡50小时,用45L的乙酸乙酯渗漉,收集渗漉液,55°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯(1:0→5:5)混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙酸乙酯反复重结晶纯化,即得。实施例3青蒿叶1kg干燥后,粉碎,用7L石油醚浸泡70小时,用75L的石油醚渗漉,收集渗漉液,60°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有45倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯(1:0→5:5)混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙醇反复重结晶纯化,即得。实施例4青蒿叶1kg干燥后,粉碎,用8L丙酮浸泡48小时,用60L丙酮渗漉,收集渗漉液,50°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚-丙酮=(1:0→6:4)混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经乙醇反复重结晶纯化,即得。实施例5青蒿叶1kg干燥后,粉碎,用5L乙醚浸泡50小时,用45L的乙醚渗漉,收集渗漉液,55°C以下减压回收溶剂得浸膏,用乙酸乙酯溶解后,与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合,晾干,加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离,用石油醚-丙酮=(1:0→6:4)混合溶剂梯度洗脱,以薄层层析法检测洗脱液成分,收集含青蒿素B的流份,回收溶剂至小体积,放置析出粗结晶,再经丙酮反复重结晶纯化,即得。